外周血淋巴细胞培养及染色体制备技术已广泛应用于细胞遗传学研究及染色体疾病诊断。由于该技术要求细胞培养时间较长、制备过程复杂，因而易受温度、湿度、PH值、溶血和凝血等因素影响而导致实验失败。因此，控制好每一个实验步骤，对于实验的成败至关重要。而个别标本仍然存在无法进行核型分析的现象，对于这部分标本重点分析其失败原因。

一.实验步骤及控制措施

1.标本采集、接种与培养：

将患者采血部位进行常规消毒，用5mL一次性无菌注射器或采血针采血约3mL，注入5mL无菌的肝素锂抗凝管，颠倒混匀。加强门诊、住院部标本采集人员的培训，标本必须无菌采集，避免溶血、凝血。

在生物安全柜内，用一次性无菌注射器（2.5mL）抽取抗凝血，向培养瓶内（含5mL人体外周血淋巴细胞培养基）接种，每瓶0.4mL，至少接种两瓶，接种后轻轻水平摇动几次混匀。分别直立于两个37±0.5℃培养箱内培养66~72h，注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌等现象。所有用于细胞培养的培养液和细胞学处理的试剂，必须做预试验，新批号试剂到货后必须做批间验证试验。

2.细胞的收获、制片：

培养终止前需在生物安全柜内向培养基中加入秋水仙素，秋水仙素的最终浓度为0.1~0.5μg/mL，轻轻摇动混匀，37±0.5℃培养箱中处理1.5h。秋水仙素处理完毕后，小心地从温箱取出培养瓶，用吸管吸取培养物入离心管，离心：1500r/m×10min。弃上清液，然后加入37℃温育的0.075mol/L的KCl低渗液8~10mL，用吸管吹打成细胞悬液，置37℃水浴处理25min。在每个离心管中加入1.5mL的卡诺固定液( 甲醇: 乙酸 3:1)，轻轻吸吹混匀，室温下放置10min。离心：1500r/m×10min，弃上清液。然后在离心管中加入卡诺固定液8mL，立即用吸管轻轻吹打成单个细胞悬液，室温下放置30min，离心：1500r/m×10min，弃上清液，如此重复3次。秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。两种情况都不宜观察形态及计数，故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。但固定后混匀细胞一定要轻，否则引起细胞破裂、染色体丢失。

在离心管中滴入新鲜固定液0.2~0.5 mL，用吸管将淋巴细胞团轻轻吹打成细胞悬液，从冰箱内取出冰片，每片滴加悬液2~3滴，75℃烤片2~3h。载玻片一定要洁净冰浴，否则染色体分散不好。制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开，可将固定时间延长数小时或适当提高冰醋酸比例。

3.显带和染色

将50mL pH为7.4的1/15M磷酸盐缓冲液倒入立式染色缸内，加入2.5%胰蛋白酶溶液0.5mL，混匀。胰酶消化后用10%Giemsa染液染色3min，然后用镊子夹出玻片，用自来水轻轻冲洗两面，电吹风吹干。每次显带均应做预实验处理，以决定正确的显带时间，不可盲目处理所有玻片。显带效果的判断，应多观察几个长度适中的分裂相，不能仅凭1、2个分裂相的显带效果决定下一步显带时间。

二.培养失败后的原因分析

就2015年而言，截至目前1500例标本，有10例标本培养制片后不能用于染色体分析。外周血染色体制备为手工项目，其过程繁琐，每一环节都要严格把关。本室工作人员均经过严格培训，考核合格后才能上岗。这10例培养失败的标本，其原因均已排除由工作人员操作失误导致。而实验室的设施环境均满足实验要求。因此，我们对这六位患者进行电话回访，发现共同特点是使用了抗炎药物，尤其是儿科住院患者占多数。

抗生素类药物可能对淋巴细胞的转化产生抑制作用而影响培养质量。对这部分患者，我们建议停药后至少两周再重新采血复查。有4例患者经重新采血培养后淋巴细胞量增多，可以用于染色体分析，均已发报告。1例患者重新采血后仍未见有效的分裂相，电话回访得知还在继续服用中成抗炎药。还有5例患者至今仍未复查。

三.纠正及预防措施

对于外周血染色体制备失败的病例，我们首先排除人为失误及实验室设施环境的影响，在同等条件下再考虑是否是病例本身的原因。因此采用的纠正措施是：告知患者标本培养失败，原因可能与使用抗炎药物有关，建议停药至少两周后重新采血复查。

目前我室在采集标本前均询问患者病史，因此通过询问是否使用抗炎药物来预防培养失败率。告知染色体检查不是急查项目，可以停药后再来检查。

总之， 要制备出良好的染色体标本进行核型分析，对细胞培养、制片和显带， 每一个步骤都不能忽视。需在操作过程中不断的总结经验，以便提高外周血染色体标本制备的成功率。

遗传组 杨丽/文