慢性乙型肝炎病毒感染与单核苷酸多态性研究的新进展
师志云
一
、HBV流行病学研究进展
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是有包膜的小DNA病毒，造成全球约20亿人感染。HBV感染后可以引起急性或慢性肝脏疾病，包括急性或慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）等。其中，慢性HBV感染被公认为是HCC的重要危险因素。急性HBV感染阶段机体清除病毒失败将发展为慢性HBV感染，包括无症状携带和慢性乙型肝炎。目前，全球约3.5亿人为慢性HBV感染者，其中75%分布在亚太地区。尽管自1992年我国将HBV疫苗纳入计划免疫，HBV表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)携带率逐渐下降，但是目前我国仍有约9,300万慢性HBV感染者，其中慢性乙型肝炎患者约3,000万，每年死于肝硬化和HCC等慢性HBV感染相关的疾病者约30万。慢性HBV感染已成为严重危害我国人民健康的重大公共卫生问题之一。
HBV主要通过非消化道途径传播，皮肤或黏膜接触含HBV的血液或体液
（如精液、阴道分泌物）后可能会感染HBV。感染HBV的高危行为包括输注未经检测的血液、性乱交、共用注射器、纹身、在医疗行业工作、肾脏透析以及与HBV感染者长期共同生活并亲密接触。不同地区HBV的传播方式有一定的差异。在西欧和北美等HBV低流行区（HBV感染率为0.1%-2%），主要是水平传播方式，包括性传播、血源性传播等，通常是成年人经上述高危行为感染。在我国和其它一些亚洲国家等HBV高流行地区（HBV感染率为8%-20%），垂直传播方式，即母婴传播，也是重要的传播途径，我国HBV感染者的产妇血清e抗原(HBV e antigen, HBeAg)阳性率达到40%，HBeAg阳性的产妇90%会将HBV传染给新生儿。
感染年龄是HBV感染慢性化的重要危险因素。不同年龄的人感染HBV后，对HBV的清除能力不同。婴儿期感染HBV后，90%将发展为慢性HBV感染；1-5岁的儿童感染HBV后，20-30%将发展为慢性HBV感染；而5岁以上免疫力正常的儿童及成人感染后，超过90%可以自发清除病毒，仅低于10%的感染者会发展为慢性HBV感染。流行病学调查提示男性、慢性饮酒及其它肝炎病毒（如丁型肝炎病毒）的合并感染也是慢性HBV感染的危险因素。
尽管很多流行病学研究证实慢性HBV感染是HCC的主要危险因素，但是慢性HBV感染的机制至今尚不清楚。HBV本身并没有细胞致病性，但是HBV感染后会造成一系列肝脏疾病，主要是因为机体免疫系统在控制HBV复制过程中造成各种程度的肝细胞损伤，与此同时，HBV也会有各种策略逃避机体的免疫攻击，进而使HBV感染迁延不愈或不断复发。本综述从HBV病毒学、HBV序列变异及拷贝数变化、宿主对HBV的免疫应答以及宿主遗传易感性四个方面探讨慢性HBV感染及转归的影响因素，希望有益于识别慢性HBV感染的易感个体，进而选择合适的抗病毒药物和制定更好的治疗策略。
二、单核苷酸多态性研究进展
“人类基因组计划”揭开了人类遗传信息的面纱。单核苷酸多态性(single nudeotide polmorphisis SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，而且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%，包括置换、颠换、缺失和插入。单核苷酸多态性是人类遗传变异中最常见的一种，占所有己知多态性的90%以上。通常认为，SNP是双等位基因的转换和颠换，二者之比为2:1。单核苷酸多态性最常出现在CG序列上，而且多是C转换为T，原因是CG中的C常呈甲基化，可自发地脱氨而成为胸腺嘧啶。SNP的数量大、分布广及高度稳定性等特点使其在临床检验、分子诊断、法医学、病原检测、遗传性疾病和新药研发等方面具有重要应用价值。单核苷酸多态性的检测分为两大类，一类为己知位点即候选基因的检测，另一类为未知基因的检测，即在没有任何假设的情况下筛选SNP位点并进行验证。以全基因组关联分析为代表的SNP筛选是目前较为流行的趋势。
自2005年Science杂志上报道了第一篇全基因组关联分析研究的与年龄有关的黄斑变性的文章，全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS）己发现许多SNPs与人类复杂疾病如糖尿病、高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、肥胖、HBV感染的发生相关。GWAS一般分为两阶段研究，第一阶段先在小样本中对全基因组范围内选择的SNPs进行基因分型，筛选对疾病易感的SNPs，第二阶段在大样本中对第一阶段筛选的阳性SNP位点进行基因分型。第一阶段的筛选可以以个体为单位，也可以采用DNA pooling的方法，DNA pooling可以使基因筛选的工作量大大降低，且多项研究已经证明DNA池结合Affylnatrix工作台是一种低成本、高效益的筛选SNP的方法。研究表明，DNA pool估计的等位基因频率其标准差在1-4%，这种标准差对全基因组的病例对照研究的把握度影响是不可忽视的。如果采用以DNA pool为基础的全基因组扫描和个体基因分型结合的方法，则不失为一种理想的即经济又有较高把握度的研究策略。以DNA pooling为基础的两阶段的研究策略仍有一些问题值得探讨：1.如何保证第一阶段研究以最大的可能性筛选出与疾病或表型关联的SNPs。2.在统计分析中控制了假阳性率后如何同时保证研究的把握度。3.如果在两阶段研究完成后与疾病或性状相关的SNPs被筛选出来，一项研究至少筛选出一个疾病或性状相关位点的概率有多大。4.尽管研究表明两阶段的研究呢可以减少基因分型的工作量，但这样是否降低了研究的把握度。这些问题的阐述有待于进一步的研究。
三、单核苷酸多态性影响宿主对HBV疫苗的敏感性
乙型肝炎疫苗自19世纪80年代问世以来在预防HBV感染方面发挥重大作用。婴儿期乙肝疫苗接种的有效率达到95%，使HBV感染率较前下降。冈比亚长期的研究显示婴儿期免疫接种是安全的，是一种很好的被动免疫方法。并非所有接种乙肝疫苗的人都是有效的，大约有5%的人接种乙肝疫苗后不会产生HBsAb，有的人即使接种成功后当再次遭受HBV感染时仍不能将病毒清除。HBV疫苗诱导的免疫反应受多种因素的影响，包括疫苗的类型、给药途径、宿主的年龄、性别、受紫外线照射程度、吸烟、共同感染其他病毒和宿主营养状况。研究显示宿主对HBV疫苗的免疫反应是受宿主基因组影响的。家族性研究和双胞胎研究显示宿主的基因组变异影响HBV疫苗诱导的免疫反应。一项对冈比亚207例双胞胎自出生起就进行的研究，比较单卵双胞胎和双卵双胞胎环境和宿主基因组变异对乙肝疫苗的引起的免疫反应的影响，个体间的抗体反应和细胞因子反应不同。乙肝疫苗遗传力估计值为77%（95%可信区间63-85%）。病例对照研究显示，宿主基因组变异影响HBV疫苗诱导的免疫反应。一些研究显示乙肝疫苗接种失败与某些HLAII型等位基因尤其是DRBI*0301，DRBI*0701和DQBI*0201相关。而一些HLA11类等位基因如DRBI*0101，*1301，*1501和DPBI*0401的存在促进HBV疫苗的免疫反应。细胞因子的多态性和乙肝疫苗抗原反应相关。IL-lB与HBV疫苗的免疫反应相关:与携带IL-1B（+3953）较大等位基因的人相比，携带IL-1B（+3953）较小等位基因的人注射HBV疫苗后HBsAb滴度高（p=0.004），且HBsAg接种后T淋巴细胞增殖反应较强（p=0.001）。但是印度尼西亚的一项对914个基因包括5000个SNPs的研究显示，基因组的遗传变异不影响宿主对HBV疫苗的反应。一项冈比亚人宿主遗传变异包括133个基因上715个SNPs与HBV疫苗免疫反应的研究未发现明显相关性。Ryckinan等对652位冈比亚人进行的一项宿主基因组的遗传变异与HBV疫苗免疫的研究，对117个基因上的688个SNPs进行单倍型分析，发现5种基因（Cn44、Cn58、CDC42、IL19、ILIRI）中都至少有一个单倍型与HBV疫苗诱导的免疫反应相关。
四、HBV基因组变异影响持续性HBV感染及慢性HBV感染者的疾病进展
乙肝病毒（HBV）属于肝DNA病毒科，是一环状的部分双螺旋结构，HBV-DNA全长大约3.2kb。HBV基因组包括4个开放阅读框（C区、S区、P区和X区），分别编码病毒的核壳(C)蛋白、包膜(S)蛋白、病毒复制酶(聚合酶)及一种与病毒基因表达有关的X蛋白。HBV基因组自身的变异影响HBV持续性感染及慢性HBV感染者的疾病进展。HBV基因组最常见的核心启动子的变异位点是A1762T和G1764A。美国一项对694位慢性HBV感染者的横断面研究显示，A1762T和G1764A的变异在36%的HBeAg阳性患者和51%的HBeAg阴性患者中存在。一些研究显示，HBV基因组A1762T和G1764A的变异与HBV患者血清转氨酶升高和肝脏较重的坏死性炎症反应相关13.Fang等对中国广西年龄在30至55岁之间的2258例HbsAg阳性患者进行HBV基因组核心启动子区变异研究，发现1261例HBV感染者为HBV基因组A1762T和G1764A双变异，997位患者为野生型。经过36个月的随访，61位患者发展为原发性肝癌，其中54例为AI762T和G1764A双变异患者，7例为野生型患者，说明HBV基因组A1762T和G1764A双变异患者对肝癌的遗传易感性明显增加（RR=6.23，p<0 .001）；分层分析发现，a1762t和g176状双变异的男性hbv感染者较女性患者更易发生肝癌（rr="11.54，p<0.001）。Yin等收集中国大陆1459例慢性HBV感染者，其中包括846例无症状HBV感染者、235例慢性乙型肝炎患者、188例肝硬化患者和190例原发性肝癌患者，提取患者血清HB从DNA，对其核心启动子区测序发现，与无症状HBV感染者相比，HBV基因型C感染者中，nt,1674、nt.1719、nt,1762、nt.1764、nt.1846、nt.1896和nt.1913的变异与慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌的发生相关。与慢性乙型肝炎患者相比，HBV基因型C感染者中，C1673T、A1726C、A1727T、C1730G、C1766T、T1768A、C1773T和C1799G的变异和肝硬化的发生相关。以肝硬化患者作为对照，HBV基因型C感染者中，C1673T、A1726C、A1727T、C1730G、C1766T、T1768A、C1773T和C1799G的变异和肝癌的发生相关。以无症状HBV感染者和慢性乙型肝炎患者作为对照，年龄较大、男性、血清ALT升高、HBV基因组T1768A、A1762T、G1764A和A1846T的变异均是HBV感染者发展成肝硬化的独立性危险因素。以没有肝癌的HBV感染者作为对照，年龄较大、血清A耳水平升高、血清HBV-DNA大于等于104copies/ml、HBv基因型C和HBV基因组C1653T、T1674C/G、T1753V和A1762T/G1764A的变异均是HBV感染者发生肝癌的独立性危险因素。单倍型分析显示，HBV基因组两个或多个位点的变异是肝癌发生的危险因素。HBv-DNA变异位点T1674e/G、el653T和T1753V是肝癌特异性变异位点。HBV-DNA变异位点A1762T和G1764A对肝癌的特异性和敏感胜居中，Mu等研究HBV基因组核心启动子区中国A176ZT和G1764A双变异与中国启东地区肝癌患者的关系，病例组为345例死于HBV相关的肝癌的男性患者，对照组为625例性别、年龄、乙肝状况与病例组匹配的HBV感染者，发现81%的肝癌患者(278例)为A1762T和G1764A双变异，对照组中A1762T和G1764A双变异的比率为40%(250例)，说明HBV基因组核心启动子区中国A1762T和G1764A双变异促进肝癌的发生(OR=6.72，95%CI：4.66-9.68)，且双变异患者的血清HBV-DNA水平越高，肝癌发病风险越大。
五、单核苷酸多态性影响持续性HBV感染
Kamatani等对持续性HBV感染进行了两阶段的基因组关联分析，第一阶段对179例日本慢性乙型肝炎患者和934例无乙肝的日本人进行全基因组扫描(Illumina Human Hap 550 Bead chip)，挑选12000个SNP位点在607例日本慢性乙型肝炎患者和1267例无乙肝的日本人中验证，发现n个关联性最强的SNPs，这些SNP位点位于HLA-DPA1和HLA-DPB1基因区域，然后从这11个SNP位点中挑选两个关联性最强的SNP位点(rs3077和rs59277535)进行第二阶段验证，第二阶段验证人群包括274例日本慢性乙型肝炎患者和274例无乙肝的日本人，718例日本慢性乙型肝炎患者和1280例无乙肝的日本人和308例泰国慢性乙型肝炎患者和546例无乙肝的泰国人，发现SNP rs3077(OR-0.56，95%可信区间0.51-0.61，p=6.34Xl0-38)和rs9277535(OR-0.57，95%可信区间0.52-0.62，p=2.3lX10-39)与乙型肝炎的持续性感染强相关；且单倍型分析发现，HLA-DPA l*0202-DPB1-*0501(OR=1.45，95%可信区l.16-1.81，p=5.79X10-6)和HLA-DPAl*0202-DPBI*0301(OR=2.31，95%可信区间1.39-3.84，p=0.002)是HBV持续性感染的危险单倍型，单倍型HLA-DPAI*0103-DPBI*0402(OR=0.52,95%可信区间0.35-0.75，p=6.0X10-8)和HLA-DPA1*0203-DPBI*0402(OR=0.57，95%可信区间0.33-0.96，p=0.002)是慢性HBV感染的保护性单倍型。HLA-DPAI和HLA-DPBI上的SNPrs53077和rs59277535与持续性HBV感染的强相关性在中国人中也得到验证：Wang等在中国汉族人和中国壮族人中验证遗传变异位点rs3077和rs9277535与中国人HBV持续性感染的关系，发现中国汉族人中遗传变异位点rs3077和rs9277535处A等位基因携带者发生慢性乙型肝炎的风险下降；中国壮族人中rs59277535处A等位基因携带者发生慢性乙型肝炎的风险下降(OR=0.606，95%：0.441-0.533，P=0.002)。Ping等也发现SNP rs3077处T等位基因增加中国人清除HBV感染的能力。Lei等发现Furin基因Pl启动子区基因多态性-229C/T影响中国汉族人HBV持续性感染，携带T等位基因的人容易发生持续性HBV感染，且功能学研究发现，该位点T等位基因携带者该基因的转录活性是C等位基因携带者的3倍，T等位基因包含一个欠佳的NF-E2结合柱。Deng等发现雌激素受体a(ESR1)的遗传变异影响中国人持续性HBV感染：随机选取27位中国人对ESRI基因测序，选取两个单倍体标签SNP(T29C和A252966G)在1277例持续性HBV感染者和748例自发性痊愈患者中验证，发现29TT基因型携带者持续性HBV感染的易感性增加(OR=l.41,95%可信区间1.17-1,71,p<0 .001)：29t等位基因携带者与持续性hbv感染的高度易感性在293例hbv感染的核心家庭中也得到证实；且snp t29c在esr1基因的启动子至第三内含子区域连锁不平衡，说明esr1基因的遗传变异影响中国人hbv持续性感染。
六、单核苷酸多态性对重症乙型肝炎的影响
重症乙型肝炎以肝功能衰竭和肝性脑病为特征。重症乙型肝炎发生的主要原因是病毒感染(如HAV、HBV)、药物(如扑热息痛)、不良的药物反应、毒物摄入和代谢性疾病和其他如肝豆状核变性、布加氏综合症。我国是HBV高发区，一般人群HBsAg流行率为7.18%，我国HBsAg携带者人口数大约为9300万，其中慢性乙型肝炎患者约为2000万。我国重型肝炎多由病毒，尤其是HBV诱发(70%)，表现为以黄疽和凝血障碍为主的肝损伤(通常凝血酶原活动度小于等于40%，血清总胆红素大于等于10X正常值上限)。急性HBV感染或慢性HBV感染者的疾病复发均可诱导重症乙型肝炎的发生。HBV复发可以是自发性的或由某些因素如化学药物或核苷类似物耐药变异诱发。重症乙型肝炎来势凶猛，进展迅速，病死率高，死亡或需要肝移植的比率可以达到80%。重症乙型肝炎分为急性肝衰竭（acuteliverfaifure, ALF)、慢加急性肝衰竭(acute-on-chronichverfailure, ACLF)和肝脏疾病末期的肝功能慢性失代偿。乙型肝炎重症化是多基因(病毒基因组和宿主基因组)、多因素(病毒因素、环境因素和宿主因素)疾病。Huang等对台湾204例HBV感染者(男性131例，女性73例)进行了前瞻性队列研究，发现HLA-DRBI*1101降低台湾男性HBV感染者发生重症乙型肝炎的风险(OR=0.23,p=0.02) Suneetha等研究VDR、CCR5、TNF-a和TNF-b基因多态性和印度慢性重症乙型肝炎的关系，收集214例慢性HBV感染者和408例对照，发现CCRS杂合子对慢性乙型肝炎易感性较高(4.2%vs0.73%)，VDRApal/a和TNF-bA/A与乙型肝炎的严重程度相关；VDRa/a等位基因与HBv感染者HBV-DNA升高相关。Yan等研究IL10启动子区A-1082G，T-819c，A-592C基因多态性与与中国人重症乙型肝炎的关系，包括414例健康对照、367例无症状HBV感染者和345例HBV相关的重症乙型肝炎患者，发现A-592C和T-819c基因多态性与HBV相关的重症乙型肝炎的易感性相关。单倍型-1082A-819C-592C增加HBV感染者发生重症乙型肝炎的危险性(P=0.0002,0R=1.60,95%Cl,1.25-2.07)。
七、单核苷酸多态性对乙肝肝硬化的影响
某种因素持续刺激肝脏，使淋巴细胞大量浸润，释放大量的炎症介质和细胞因子，肝细胞变性、坏死，在肝小叶内形成纤维隔、再生结节，致使肝硬化的形成。引起肝硬化的病因很多，如病毒性肝硬化、酒精性肝硬化、血吸虫性肝硬化和原发性胆汁性肝硬化。肝硬化形成的原因在欧美国家以酒精为主，在我国以病毒为主。在我国，大约5-10%的慢性乙型肝炎患者发展为肝硬化，30%的慢性丙型肝炎患者发展为肝硬化，Fattovich等对70例高加索HBeAg阳性的慢性HBV感染者25年的随访发现，61人(87%)发生了HBeAg血清转化，61人中有40人变成非活性HBV感染者，21人血清谷丙转氨酶升高；21人中1人出现了HBeAg复发，9人血清HBv-DNA阳性但是HBeAg阴性，8人出现合并病毒感染，3人并发非酒精性脂肪肝，5人死于肝癌，6人死于肝衰竭。随访研究发现，HBeAg阳性、年龄较大、男性、肝硬化是肝相关性死亡的独立性危险因素。Chu等对非活性HBV感染者进行前瞻性研究，研究非活性HBV感染者与肝硬化的关系，对1965例非活性HBV感染者(HbeAb阳性，血清ALT水平正常)平均11.5年的随访，314人发生HBV反复(血清ALT高于正常值2倍，血清HBV-DNA阳性)，年龄较大(P<0 .0001)和男性(p<0.0001)是非活性hbv感染者发生hbv反复的独立性危险因素。1965例hbv感染者中有57人发生肝硬化。非活性hbv感染者进展为肝硬化的危险因素是年龄较大和hbv反复(p<0.0001)。1651例未发生hbv反复的非活性hbv感染者中10人发展为肝硬化，年龄较大是唯一危险因子(p="0.03)；314位发生HBV反复的非活性HBV感染者中47人进展为肝硬化，随访发现发生HBV反复后5、10、15、20年时肝硬化的发病率分别为8%、16%，27%和46%，且年龄较大(P=0.006)和男性(P=0.037)和发生HBV反复的非活性HBV感染者进展为肝硬化的两大危险因素。
八、单核苷酸多态性对HBV相关性肝癌的影响
原发性肝癌是世界上第五位最常见的恶性肿瘤,肿瘤致死率占据世界第三位。亚洲特别是亚洲东部和亚撒哈拉地区是肝癌的高发地区，北美和大部分欧洲国家肝癌发病率较低。HBV感染是肝癌发生的一个很重要的危险因素，尤其是在肝癌高发地区，但是只有一小部分HBV感染者会发展成肝癌(全世界范围内男性HBV感染者肝癌的发病率从33.5至2632每10万人每年不等)，这说明肝癌的发生是病毒、环境和宿主基因之间的共同作用。尽管乙肝病毒引起肝癌的具体机制尚不清楚，HBV感染者发生肝癌的风险较无乙型肝炎的人高100倍。肝硬化也是肝癌发生的一个危险因素。Zhang等对中国广西355例乙肝相关性肝癌患者和360例无肝癌的HBV感染者基因组关联分析，筛选感染乙型肝炎的肝癌患者的遗传易感基因，发现染色lp36.22处KIFIB基因上的sNPrsl74ol966的遗传变异与乙肝相关性肝癌的发生强相关，并且这种高度易感性在5个独立人群(广西348例乙肝相关性肝癌患者和359例无肝癌的慢性乙型肝炎患者、北京276例乙肝相关性肝癌患者和266例无肝癌的慢性乙型肝炎患者、江苏507例乙肝相关性肝癌患者和215例无肝癌的慢性乙型肝炎患者、广东751例乙肝相关性肝癌患者和509例无肝癌的慢性乙型肝炎患者和上海428例乙肝相关性肝癌患者和440例无肝癌的慢性乙型肝炎患者)共1%2例乙肝相关性肝癌患者和1430例无肝癌的慢性HBV感染者和159个HBV相关性肝癌的核心家庭中均得到验证。SNPrs17401966在244kb区域内连锁不平衡，该区域从UBE4B基因3端延伸至PGD基因，染色体lp3622(基因UBE4B-KIFIB-PGD区域)被认为是乙肝相关性肝癌遗传易感性定位。为了探索影响肝癌和肝硬化发生的易感基因，Clifford等对韩国人进行了全基因组关联分析。AffymatrixSNP6.0微阵列平台筛选肝硬化和肝癌的易感拷贝数变异位点(copy number variation CNV)和SNPs，发现T细胞受体Y和a的拷贝数变异促进肝癌发生；MHCII类分子区域的3个SNPs和肝癌的发生相关，且这三个强相关的SNP位点的连锁不平衡区域没有重合。SNPrs9267673和SNPrs2647073与肝硬化的发生相关(P值分别为0.0052和0.0007)。Deng等通过对cxcL10基因全基因组测序发现其启动子区存在单核昔酸多态性,且SNPG-201A与中国汉族慢性HBV感染的疾病进展(重症乙型肝炎、肝硬化和肝癌)相关，这种强相关性在北京(283例非进展性HBV感染者和330例进展性HBV感染者)和重庆(970例非进展性HBV感染者和8170例进展性HBv感染者)HBv感染者中均得到验证，且功能学研究发现，SNPG-20lA改变核蛋白亲和力并影响CXCL10基因的表达。
小结与展望
随着全基因组关联分析研究的深入，越来越多的SNPs被发现和被深入研究，越来越多的研究显示宿主基因多态性影响持续性HBV感染和慢性HBV感染者的疾病进展：重症乙型肝炎、肝硬化和肝癌，随着研究的深入，希望在不久的将来单核苷酸多态性能走向临床，为众多的乙型肝炎患者服务。
