分子诊断在肿瘤个体化治疗中的应用

陶佳

子诊断（molecular diagnosis）是应用分子生物学方法检测患者体内编码与疾病相关的各种结构蛋白、酶、抗原抗体、免疫活性分子的基因。主要通过检测DNA、RNA和蛋白质等分子水平的变化来确定疾病的类型。分子诊断的发展已对临床医学实践产生了深远影响，尤其近年来，随着人类基因组计划的巨大成功，相关医学研究迅速进展，已经研究明确的和遗传、疾病、药物代谢等性状相关的分子(基因)标志越来越多。相对于传统检验技术，分子诊断具有特异性和灵敏度高、检测速度快、窗口期短、直接揭示疾病发生原因等优势。另一方面，随着专业知识和技术的普及，分子诊断已经成为医学检验领域一个新兴和快速发展的分支。个体化治疗（personalized Medicine）是指通过检测患者体内的有关药物作用靶位、路径、代谢等靶标，评估药物可能对患者的作用，提高治疗的针对性和有效性，避免不良反应，降低治疗风险和费用，为患者争取宝贵的医治时间。个体化治疗在肿瘤治疗中发挥越来越重要的作用。肿瘤的个体化靶向治疗是一种全新的治疗方法，其原理是利用肿瘤细胞与正常细胞的分子生物学差异进行药物开发，药物作用于肿瘤细胞特异靶标，例如与细胞信号传递有关的受体，激酶及其它蛋白，从而达到特异杀伤或抑制肿瘤细胞的目的。对肿瘤患者进行基因改变的检测，能对靶向治疗的效果进行前瞻性的预测，为医生临床用药提供良好参考，提高靶向治疗的准确性和精确性。如果病人存在基因突变或者其它基因形态改变，则使用靶向治疗，为病人带来积极治疗效果和重生的希望。如果病人不存在突变和其它基因形态的改变，则可为病人寻找其他更合适的治疗手段，既节省了宝贵的治疗时间，也避免了不必要的花费。本文将探讨目前研究较多用于肿瘤个体化治疗的分子诊断技术。

1.VEGFR突变检测和非小细胞肺癌

VEGFR（表皮生长因子受体）表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，VEGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。10-80%非小细胞肺癌患者高表达VEGFR，并且在酪氨酸激酶区域的18-21号外显子上常发生突变，主要表现为19号外显子缺失（45%）和21号外显子亮氨酸碱基替代（L858R）（41%）。VEGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物吉非替尼（gefitinib）和尼罗替尼（erlotinib）已分别于2002年和2003年经FDA批准为治疗肺癌的药物，它们通过阻断VEGFR的活性抑制其磷酸化和信号传导，从而起到抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。研究发现，仅10%的肺癌患者对吉非替尼和尼罗替尼有效果，主要是有VEGFR突变的非小细胞肺癌患者。因此VEGFR突变的检测能够为患者选择何种药物提供依据，不仅能供医生选择更好的治疗方案，同时也为患者节省了大量的医药费用。

2.K-RAS基因突变检测和转移性结直肠癌

抗-VEGFR的单克隆抗体帕尼单抗（Panitumumab）和西妥昔单抗（Cetuximab）已被FDA批准为治疗转移性结直肠癌的药物。RAS基因家族由KRAS、HRAS、NRAS组成，几乎15%~20%人类肿瘤中会出现RAS基因突变，结直肠癌中K-RAS突变率达到35~45%，而HRAS和NRAS突变仅有1~3%。K-RAS是VEGFR下游信号通路中的重要分子，研究发现结直肠癌患者体内K-RAS基因是否突变会影响患者对帕尼单抗和西妥昔单抗的敏感性。因为K-RAS突变型编码异常的蛋白，会促进恶性肿瘤细胞的生长和扩散；并且不受上游VEGFR的信号影响，所以对抗-VEGFR抗体的治疗效果差。故对K-RAS基因突变的检测已成为预测结直肠癌患者对VEGFR抗体治疗效果的重要的分子标志，能够帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法，实现肿瘤病人的个体化治疗。目前在欧美国家，大肠癌患者内科治疗前已经常规检测K-RAS状态，并且成为能否报销相关抗-VEGFR治疗费用的凭据。

3.BRAF基因突变检测和 黑素瘤

根据突变基因的不同，恶性黑色素瘤分为不同的亚型，这也决定了不同的亚型应该用不同的药物，有针对性的为病人选择治疗方案。BRAF基因表达产物苏氨酸特异性蛋白激酶是RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的重要组成分子，50%-70%黑素瘤患者存在BRAF基因突变，这也使得BRAF基因成为黑素瘤中最易突变的致癌基因。其中600位缬氨酸被谷氨酸取代（BRAFV600E）是最常见突变形式，约95%的突变属于此种类型。BRAF突变后进而促进肿瘤细胞增殖和转移。CKIT基因位于人染色体4q12-13，其产物是Ⅲ型酪氨酸激酶，CKIT基因可与其配体肝细胞因子SCF特异性结合，激活细胞内信号传导途径，从而调节基因表达，控制细胞生长、增殖和分化，部分黑素瘤也存在C-KIT基因突变。维罗非尼（vemurafenib）分别在2011年和2012年被美国FDA和EMA批准为治疗有BRAFV600E基因突变的进展期黑色素瘤的药物，伊马替尼（Imatinib）是C-KIT激酶抑制剂，当肿瘤存在C-KIT基因突变时，选择伊马替尼治疗会有很好的效果。因此检测BRAF和C-KIT的突变能够为选择更好的治疗方案提供依据，做到有针对性的靶向治疗。另外，易普利姆玛（ipilimumab）是一种针对细胞毒性T细胞抗原4 (CTLA-4)的单克隆抗体，其也于2011经美国FDA和欧洲药品局批准为治疗转移性黑素瘤的药物，主要通过抑制CTLA-4抑制肿瘤源性T细胞，是一种负向的免疫调控，具体的分子机制还不清楚，还在继续探索。

4.MGMT基因甲基化检测和胶质瘤

DNA修复酶-O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）在人类由MGMT基因编码，含5个外显子，4个内含子。MGMT是一种普遍存在的DNA修复酶，可保护染色体免受烷化剂的致突变、致癌和细胞毒作用的损伤。MGMT对抗烷化剂类化疗药物杀伤肿瘤细胞的作用，是造成肿瘤细胞耐药的主要原因。因此，肿瘤细胞内MGMT活性的不同决定了其对烷化剂药物的敏感性不同。研究表明MGMT表达阳性的肿瘤细胞比MGMT表达阴性者对烷化剂抗癌药耐药性更强。基因甲基化修饰是一类发生在启动子CpG岛的表观遗传学修饰，很多基因启动子发生甲基化时都会沉默基因的表达。Esteller等证明MGMT基因启动子区CpG岛也会发生甲基化，是导致MGMT表达减少的重要机制。也就是说，当MGMT发生甲基化时，会抑制肿瘤细胞表达MGMT蛋白，从而增强肿瘤细胞对烷化剂化疗药物的敏感性，提高化疗效果。替莫唑胺（TMZ）目前唯一治疗脑胶质瘤的口服胶囊制剂，针对性强、特异性高，可透过血脑屏障，是治疗脑胶质瘤及转移瘤的特效药。TMZ的细胞毒作用主要通过DNA鸟嘌呤O6的烷基化介导，是一类烷基化药物。TMZ治疗的胶质母细胞瘤中，MGMT基因启动子甲基化病人效果比非甲基化好，提示MGMT基因甲基化的检测能预示TMZ对胶质母细胞瘤的治疗效果。Balana等发现血清中MGMT基因启动子甲基化的检测与肿瘤组织中具有显著的一致性。检测胶质瘤病人血清中MGMT甲基化状态也可用来制定个体化的化疗方。血液的采集方便，安全，这也便于化疗病人定期复查，预测化疗效果，进行选择性化疗。虽然MGMT蛋白表达水平也能指导临床治疗，但MGMT蛋白的容易受糖皮质激素、和有毒试剂的诱导而出现异常，采用免疫组化检测MGMT蛋白的活性并不十分可靠。因此，检测MGMT基因的甲基化状态更特异、更敏感，目前甲基化的检测方法越来越多，随着分子生物学技术的发展，相信会出现更准确、便捷的甲基化检测方法，并使临床应用成为可能。

5.肾癌的靶向治疗

目前，肾癌的靶向治疗主要靶点是抑制血管生成，包括抑制表皮生长因子受体(VEGFR)和血小板源性生长因子受体（PDGFR）的生成，主要是通过酪氨酸激酶抑制剂对VEGFR和PDGFR酪氨酸激酶的抑制作用实现对肿瘤细胞的抑制。舒尼替尼（Sunitinib）是第一个用于转移性肾癌靶向治疗的药物，于2006年经美国FDA批准，现已在世界各地广泛使用。舒尼替尼能够抑制多种受体的酪氨酸激酶活性，包括VEGFR和PDGFR，帕唑帕尼（Pazopanib）也是美国FDA批准的用于治疗肾癌的靶向药物，帕唑帕尼能够抑制肾癌组织中血管生成从而抑制肿瘤生长和转移。最近，FDA又批准了两种小分子抑制剂BAY 43-9006和SU 11248用于肾癌的治疗，它们不仅能抑制VEGFR和PDGFR的活性，还能抑制FMS样酪氨酸激酶3、KIT和RAF激酶等活性，抑制肿瘤生长。

目前，很多患有同种病的病人，在同样的治疗方法，同样计量的药物下，却表现出不同的治疗效果，有时候这种差异甚至是致命的。这使得个体化治疗成为了关注的重点，医生都试图通过找到不同患者之间的差异，从而选择适合该病人的治疗方案。分子诊断在肿瘤的个体化治疗中起到了重要作用，通过在分子水平检测不同患者肿瘤组织的差异，从而选择相应的敏感药物，靶向药物通过与癌症发生、肿瘤生长所必需的特定分子靶点的作用来阻止癌细胞的生长。靶向药物治疗因其具有高度选择性地杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常细胞的特点，为肿瘤的个体化治疗做出来很大贡献，随着分子诊断技术的不断发展，肿瘤的治疗也将不断的突破。