DiversiLab微生物指纹图谱系统介绍

贾伟

年来,分子生物学的理论和技术在实验诊断中的渗透和广泛应用,使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学的调查变得更加准确、简洁和快速。各种细菌基因分型技术逐渐成为临床上监测和鉴定细菌的主要手段,它在判定医院感染的暴发、确定感染的病原菌、寻找感染源以及识别一些特殊的致病菌等有着重要的作用，现介绍一种新型的分析系统DiversiLab 系统。

DiversiLab系统是基于repetitive-sequence-based PCR(rep-PCR)原理的一种新的分型方法。REP-PCR是在随机引物PCR(RAPD)基础上发展的DNA指纹图谱分析的一种新方法。利用细菌基因组中广泛分布的小的、高度保守且重复的寡核苷酸序列为引物扩增DNA,并通过电泳条带比较分析,揭示基因组间的差异和判定细菌间的亲缘关系。细菌基因组中广泛分布的短重复序列(repetitive sequence),主要有基因外重复回文序列(Repetitive Extragenic Palindromic,rep)和肠杆菌基因间共有重复序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC)。Rep序列是操纵子非翻译区的规律性序列,具有回文特征,可在被转录的RNA中形成稳定的stom-toop结构。ERIC序列是指革兰阴性杆菌中存在一段重复序列(约126bp大小的片段),位于染色体非编码转录区,包含一段高度保守的中央倒置重复区和基因外区域,遗传比较稳定,,种间仅有拷贝数和位置变化。它可应用一对反向引物扩增出两个ERIC序列之间的DNA片段。因此在菌株、种、属水平分布上存在差异及进化过程具有相对保守性。

DiversiLab系统通过rep-PCR扩增细菌基因组的非编码重复序列后根据扩增片段长度差异,形成由多条带组成的、强弱不一的rep-PCR DNA指纹图谱,从而比较菌株间的相似性.已被广泛应用于鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、分枝杆菌属、念珠菌、曲霉菌等的分子流行病学研究。

第一步

rep-PCR 引物结合到基因组上特定的重复序列片段上，扩增不同长度的DNA片段。

第二步

DNA片段根据大小及电荷不同分开。特异的rep-PCR指纹是含有不同大小及强度的图谱，这些片段通过微流体电泳分离。这项技术来源于传统的电泳，但只需仅仅少量的样本体积。在Labchip内，DNA片段插入染料，然后通过此芯片分离，不同时间激光会检测到不同强度的荧光，产生一个图像，图像再翻译成样本的指纹图谱。

可重复性强,数据标准化是DiversiLab系统最大的优势。由于采用了标准化的操作、高分辨率的微流体芯片和荧光检测系统及统一的数据处理软件，克服了早期rep-PCR重复性差的:缺点，具有较好的可重复性，且不同操作者对结果分析的差异性小，而且不同地区的数据上传到中心数据库,便于不同实验室间的结果比较。DiversiLab系统一次可分析12个样本。操作总共只需大约6-8h,并且可以“即时”生成结果。因此在细菌分型方法中,DiversiLab系统是一种快速,简单,可重复性好的分型方法,分辨率也比较高,可作为快速分型或大量菌株的分析首选分型方法。