羊水细胞培养中特殊标本的处理方法

马菊梅

近些年来随着人们对优生优育意识的提高,这对产前诊断工作的要求大大提高，羊水细胞培养检查是最经典的方法之一,但由于过去羊水细胞的培养一直存在技术要求高、容易污染、分裂相对少、成功率低的情况，为了提高了羊水细胞培养的质量,人们进行了大量的探索，逐步改良培养技术，研究者的培养细节各有优势，成功率也各不相同，本文就羊水细胞培养中特殊标本（污染标本、血性标本、沉淀量少标本、胎脂多羊水、大孕周孕妇羊水标本）培养的有关研究和实际工作经验得到的有利方法进行论述。

1污染标本处理

微生物污染是细胞培养工作的大敌,其中以霉菌污染最为常见也最难预防，一般48h可观察到。

1.1为减少操作过程中和培养箱中的霉菌污染，需定期对换液工作台和生物安全柜行紫外线消毒，对培养箱行75%酒精消毒。

1.2观察培养物已被污染，加抗生素青链酶素，浓度为15mg/ml，1天后观察，再加1次同种同量抗生素，可抑制细菌生长，保证羊水细胞生长条件。

1.3在倒置显微镜下突然出现黑色点状物或絮状物,要特别注意细菌污染,要提前收获细胞，羊水细胞消化和刮取完后，采用0. 22μm的滤菌器，可以把霉菌滤过，制备出来的片子背景不会被霉菌的菌丝影响染色体的形态分析。

2血性标本处理

羊水的颜色一般为淡黄色、清凉液体，羊膜腔穿刺术中难以避免羊水受血细胞污染。若抽取的羊水为红色,表明其中混入大量红细胞，血红素等对脱落细胞的生长有抑制作用，影响成活羊水细胞的贴壁和生长。

1.1少量红细胞不用处理，不但不影响反而会促进羊水细胞的生长，尽管受血细胞影响，羊水细胞观察有一定难度,但在制片时羊水细胞染色体分裂相并不少。

1.2若抽取的羊水中有血块，可在离心后用巴氏吸管将血块吸出，可减少血液对羊水细胞的影响。也可通过分离液分离技术，来提高羊水细胞的纯度，消除干拢物质对羊水细胞的生长影响。由于用分离液分离羊水操作复杂，容易污染，大都只采用在血性羊水中加一滴无菌肝素，以避免红细胞凝集把羊水细胞凝集起来，影响羊水细胞贴壁生长。或将羊水离心，由于红细胞比重大于羊水细胞比重，去除上清和底层红细胞，纯化羊水细胞并结合提前换液及多次换液的方法进行培养，培养时间短，有效核分裂数多，培养成功率高。

3沉淀量少标本处理

影响羊水细胞培养成功率的因素很多,但主要是羊水中存活细胞的数量和培养基的质量。

3.1好的培养基是羊水细胞培养成功的关键,我室使用的以色列BI公司生产的液体羊水培养基,相对于中国产培养基具有使羊水细胞生长旺盛、细胞周期短等优点,仅4~10天可出结果,平均7天。

3.2如果细胞克隆较少且生长的细胞数较少，培养中发现羊水培养基的颜色已由桃红色变为桔黄色，说明羊水培养基的酸碱度已有很大的变化,营养基本消耗完毕，此时需要换液增加营养，但是换液时间控制非常重要，如果太早换液，羊水细胞贴壁还不够牢固，容易造成细胞大量丢失，如果换液太晚，营养不能维持细胞的正常生长，羊水细胞容易老化，造成染色体核型分析困难。

3.4可以在细胞培养满1周后换液，进行胰酶消化，原瓶传代，使细胞在瓶底重新分布，以便获得较多的细胞克隆，当培养瓶中培养液杂质较多时，应及时换液，去除胎脂和死细胞崩解产物对细胞贴壁及细胞生长微环境的影响。为了尽可能地增加羊水细胞的数量,提高成功率,换液标本不能丢弃，要继续培养，以备复查。

3.3在抽取羊水之前，孕妇作摆臀动作，尽量使羊水细胞浮起，使羊水中含有较多活的羊水细胞。在B超显示羊膜腔时，尽可能探测到最大腔体位置，并从胎盘最薄位置进针。如果在B超无法显示较理想的羊膜腔时，最好是叫孕妇作出不同的体位和姿势，直到显示较理想的羊膜腔。

3.4在抽取羊水时，弃去前面抽取的2-3ml羊水，以防止母体血、其它液体或微小组织污染。若抽取的羊水颜色为白色浑浊，这可能表明孕周偏大或混有其它杂质，此时含有的胎脂较多，培养中要重点观察。

4胎脂多羊水处理

孕周大于25周的羊水，胎儿脱落细胞增多，羊水中有形成分增加，含有大量胎脂，影响羊水细胞贴壁生长。

4.1根据羊水中各组份比重不同，红细胞比重大于羊水细胞比重大于胎脂比重，对羊水进行预处理离心去除上清和上层胎脂细胞，纯化浓集羊水细胞进行培养，培养时间短，有效核分裂数多，培养成功率高。

5大孕周孕妇羊水处理

在孕19-24周时,羊水细胞数量多而且长势较好。现在国内大多教材和杂志报道羊水细胞染色体用于产前诊断的的最佳孕周为16-22周。孕周小于17周，细胞比较少，贴壁细胞克隆少，收获较晚。孕周越大，羊水有形成分增多（包括大量的死细胞），活细胞减少，细胞贴壁困难。另外,从细胞培养瓶中(通过倒置显微镜)可以看到，对于孕周较大的胎儿脱落细胞碎片较多，核型分析时也相对比较困难。随着科学技术的进步，培养基的营养成份更加丰富，更适合羊水细胞的生长，适应孕周范围更广、细胞生长周期更短。

5.1孕周大过27周，常较混浊，一旦发现几个贴壁克隆时就应及时换液，消除大量有形成分对贴壁细胞生长的影响。

产前诊断是一项风险高、技术难度大的医疗检测项目,目前基因芯片、FISH等方法的准确率高,检测时间快,但所需耗材和成本高,一般的患者难于承受,在普及上存在一定的难度，通过羊水细胞培养染色体核型分析诊断染色体疾病,是最安全、最经济,最有效的方法。

羊水细胞培养每一细节都关系到成败,这就要求我们对每一环节都得十分重视,只有不断摸索和分析总结经验,才能提高羊水产前诊断的效率。以上方法可增加羊水细胞培养的贴壁机率，缩短羊水细胞培养时间，提高羊水细胞培养的成功率，获得满意染色体核型，为临床发放准确及时的羊水穿刺染色体诊断报告。