血脂分析的方法学及其在糖尿病视网膜病变及肾病的应用

倪蓝

1、血脂代谢异常与糖尿病视网膜病变及糖尿病肾病

脂代谢紊乱可促进脂肪在血管壁沉积，使血液黏滞度增高，血流速度减慢，促使血细胞在微循环中的聚集，导致血管壁内皮受损，内皮功能紊乱，内皮细胞增强，导致视网膜微血管异常，改变了细胞膜脂质结构，使内皮细胞功能受损，从而使视网膜毛细血管壁变薄，最终形成微血栓，破坏了视网膜屏障功能，导致视网膜病变，可通过改变肾小球基底膜的磷酸酯成分，增加肾小球基底膜的通透性，引起蛋白的排泄，同时升高的脂类可直接导致肾小球硬化，目前的一些研究亦证实了这点。视网膜病变及糖尿病肾病是2型糖尿病主要的微血管并发症，是患者致盲及肾衰竭的主要原因。2型糖尿病患者常合并血脂异常。探讨血脂在糖尿病视网膜病变及糖尿病肾病发生、发展过程中的影响及糖尿病视网膜病变及糖尿病肾病的相关性，对糖尿病微血管并发症的预防、诊断及治疗有着重要的意义。

国内外大量研究表明T2DM糖尿病血脂代谢紊乱与大血管病变密切相关，T2DM患者常有高甘油三脂血症和低高密度脂蛋白胆固醇血症，是胰岛素抵抗的脂代谢特征及T2DM患者致冠心病的危险因素。微血管病变是糖尿病的特异性并发症，其典型改变是微循环障碍和微血管基底膜增厚，发生机制极为复杂，除了与遗传易感性、胰岛素抵抗、高血糖、氧化应激等多方面因素的相互影响等其他慢性并发症的共同发病机制有关外，尚涉及以下方面：①细胞内信号转导过程异常；②细胞外信号分子调节异常，如各种生长因子和细胞因子（转化生长因子-β最为重要）、肾素-血管紧张素系统（RAS）异常等；③全身因素引起的局部变化，如高血压、血脂异常、交感神经系统活性异常等。微血管病变主要表现在视网膜、肾、神经和心肌组织，其中尤以糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变为重要。

1.1糖尿病肾病

糖尿病肾病（Diabetic-Nephropathy，DN）：常见于病史超过10年的患者。其病变改变有3种类型：①结节性肾小球硬化型②弥漫性肾小球硬化型③渗出性病变。糖尿病肾损害的发生、发展可分五期：Ⅰ期：肾脏体积增加，肾小球滤过率增加；Ⅱ期：正常白蛋白尿期（尿白蛋白<30mg /24h），基膜增厚，系膜基质增加，肾小球滤过率升高，血压多正常；ⅲ期：早期糖尿病肾病，尿白蛋白30~300mg/24h，肾小球基底膜增厚和系膜基质增加明显，血压轻度升高，肾小球出现结节型和弥漫型病变并出现肾小球数目减少；iv期：临床糖尿病肾病，大量蛋白尿，血压升高，肾小球基底膜明显增厚，破坏的肾小球增加；v期：终末期肾功能衰竭。国内外研究多项研究表明，糖尿病肾病是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，其发病率高达47.6%，并发心脑血管疾病的死亡率比普通人群高20~30倍。

1.2糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变（Diabeticretinopathy，DR）：DR是糖尿病主要微血管并发症之一，是DM患者致盲和视力受损的主要原因。DM患者失明5的发生率是一般人群的25倍。2003年全球DM人数为1.94亿，2025年预计将达3.33亿，其中绝大多数为T2DM。视网膜改变可分为六期，分属两大类。I期：微血管瘤、小出血点；II期：出现硬性渗出；III期：出现棉絮状软性渗出。以上I~III期为背景性视网膜病变。IV期：新生血管形成、玻璃体积血；V期：纤维血管增殖、玻璃体机化；VI期：牵拉性视网膜脱离、明。以上IV~VI期为增殖性视网膜病变。

1.3 2型糖尿病与脂代谢异常

2型糖尿病常常伴脂代谢异常，其特点是血清甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）增高，高密度脂蛋白（HDL）降低的三联征。脂肪代谢是一种复杂的、动态的生理变化过程。2型糖尿病合并的高脂血症是含有多变数、多相关成分的病理过程，其相关因素交互作用机制的复杂性，更增加了人们对其认识的难度。目前有大量的国内外临床研究证明，血脂代谢异常在糖尿病肾病及糖尿病视网膜病变的发生、发展中起到重要作用，同时糖尿病视网膜病变及糖尿病肾病之间存在相关性。

1.3.1血脂代谢异常与糖尿病肾病之间的关系

大量的临床研究证明糖尿病肾病与甘油三酯和小而致密的低密度脂蛋白升高、高密度脂蛋白胆固醇减低有密切关系。国内学者证明：糖尿病肾病患者TG、LDL-C水平高于DM组，这种变化在微量白蛋白尿时期已经出现，在明显蛋白尿期及肾功能衰竭期，LDL以及载脂蛋白残核样颗粒（RLP）显著增多。接受血液透析的DN患者，其血中LDL水平升高的同时，伴有甘油三酯脂酶（HTG-L）活性下降，从而推测HTG-L活性下降与DN晚期脂蛋白异常相关。DN较DM患者血中LDL颗粒更小，密度更高，这种小而密度高的LDL颗粒是动脉硬化性心脑血管病的独立危险因素。日本学者研究发现，DN患者血脂蛋白脂酶（LPL）总量低于DM患者，由于DN患者存在全身广泛的内皮细胞功能受损，导致附着于内皮细胞表面的LPL减少，使TG在LPL作用下分解6为游离脂肪酸的速度减慢，导致高甘油三酯血症。楼继先等的研究表明：T2DM患者视网膜病变的严重程度与HDL-c及ApoA1呈显著负相关，与TG、LDL-c及ApoB呈显著正相关。VonWillebrand factor（vWF）是血管内皮细胞合成的一种糖基化蛋白，循环血液中存在的vWF主要来自血管内皮细胞，血浆vWF水平的升高被认为是血管损伤或功能紊乱的标志。严钟德等证实了T2DM患者存在着血浆vWF的升高，而且从对不同白蛋白尿期患者血浆vWF的测定结果可发现，血浆vWF浓度不仅在早期，而且在正常白蛋白尿组便已经出现升高，提示血管内皮的损伤可能先于T2DM患者早期DN的出现。国外学者研究证明，在DN的发生、发展过程中存在着明显的血液动力学的变化，其主要表现为全血粘度、血浆粘度、血沉、红细胞压积、纤维蛋白原浓度明显升高。Hirano研究证实，在T2DM合并肾病中存在严重的脂代谢紊乱，伴有微量蛋白尿和明显蛋白尿的T2DM患者其TG水平明显升高，有明显肾病的T2DM患者的IDL和CH残余颗粒亦明显升高，与有肾脏疾病的非DM相比，在DN中LDL外形明显变小。Bonnet等研究证明，DN与脂质改变相关，这种脂质改变是以TG的升高为特征，并且在肾脏病变的早期就表现出来了。胡利东等研究证实了，血脂与T2DM患者DN的发病有关，T2DM患者TG水平升高和HDL-c水平下降，脂代谢紊乱可通过改变肾小球基底膜的磷酸酯成分，增加肾小球基底膜的通透性，从而引起蛋白的排泄，同时升高的脂类直接导致肾小球硬化。此外，国内外许多研究证实有肾功能损害的DM患者ApoE水平是明显升高的。

1.3.2血脂代谢异常与糖尿病视网膜病变的关系

国内外学者研究表明血脂代谢紊乱与DR存在一定的关系，血脂异常可能是引起DR的主要原因之一。糖尿病患者血脂异常较为常见，但高脂血症影响DR发生发展的机制尚糖尿病是常见病、多发病，其患病率正随着人民的生活水平提高、人口老龄化、生活方式的改变而增加，呈逐年增长的趋势。据世界卫生组织（WHO）估计，全球目前有超过1.5亿糖尿病患者，到2020年这个数字将增加1倍。据统计，我国现有糖尿病患者已超过4千万，居世界第2位。糖尿病已成为发达国家中继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病。目前国际上通用WHO糖尿病专家委员会提出的病因学分型标准（1999），包括1型糖尿病、2型糖尿病、其他特殊类型糖尿病、妊娠糖尿病。其中2型糖尿病患者居多，且其发病正趋向低龄化，儿童中发病率逐年升高。糖尿病的并发症包括急性严重代价紊乱（DKA和高血糖高渗状态）、感染性并发症（皮肤化脓性感染、真菌性阴道炎、肾盂肾炎、膀胱炎等）、慢性并发症。糖尿病慢性并发症可遍及全身各重要器官，普遍认为其与遗传易感性、胰岛素抵抗、高血糖、氧化应激等多方面因素的相互影响有关，主要包括大血管病变、微血管病变、神经系统并发症、糖尿病足等）。国内外大量研究表明，血脂代谢异常是糖尿病患者出现血管并发症的重要危险7不是十分明确，高血脂促进了脂肪在血管壁沉积，增高了血液黏滞度，减慢了血流速度，促使血细胞在微循环中的聚集，从而导致微循环病变，高血脂还可导致血管壁内皮受损，内皮功能紊乱，使内皮细胞增强，而使视网膜微血管异常。血脂异常改变了细胞膜脂质结构，使内皮细胞功能受损，从而使视网膜毛细血管壁变薄，最终形成微血栓，破坏了视网膜屏障功能，导致视网膜病变，造成DR的发生发展。国外Takei的研究认为DR的发生与TG、LDL-C升高，HDL-C降低有关。国内学者通过分析发现，HDL水平在I组较II组明显降低（P<0 .001）；i组tg升高，与ndr组相比差异极显著（p<0.001）；tc水平在dr组明显升高，且与ndr组间差异显著（p<0.05）；而ii与i两组间ldl水平存在显著差异，i组ldl-c明显升高（p<0.05）；说明糖尿病视网膜病变的发生与血脂的异常有关。hdl摄取肝外组织自由胆固醇，在清除胆固醇过程中起作用，国内已有研究认为dr与高tc有关。刘艳的研究认为，高血糖是dr的危险因素，并且认为早餐前血糖7.9mmol/l是预防dr发生的可建议的血糖水平，7.15mmol/l则是较为严格控制dr发生的水平。高血糖本身可以刺激血管内皮细胞分泌igf-l、β-fgf、tgfβ、内皮细胞生长因子而引起血管壁损伤。

2血脂分析检测

血脂的来源主要有两条途径，一条是外源性的，就是我们每天进食中脂类物质经消化吸收后进入血液而成；另一条是内源性的，就是在人体正常代谢过程中由肝脏、脂肪细胞及其它组织合成释放入血液。人体除脑组织及成熟的红细胞外，几乎全身各组织都可合成胆固醇。肝脏是合成胆固醇的主要场所，体内胆固醇70～80%由肝脏合成，10%小肠合成。高血压、冠心病、脑血管病、糖尿病以及肿瘤等疾病都与高血脂有关，因此血脂增高是困扰中老年人健康的祸根。

2.1血脂测定的方法

2.1.1CHOL的测定

CHOL测定分为化学法和酶法两大类。化学抽提法—ALBK法为目前国际上通用的参考方法。卫生部北京老年医学研究所生化室建立的高效液相色谱(HPLC)法也推荐作为我国CHOL测定的参考方法。 建议酶法[如胆固醇氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法(CHOD-PAP法)](以胆固醇酯酶水解血清中的胆固醇酯，同时以胆固醇氧化酶将胆固醇氧化成胆甾烯酮并产生过氧化氢，终点产物的测定应用最广的是Trinder显色反应系统，试剂含过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚。)作为临床实验室测定血清CHOL的常规方法。

2.1.2甘油三脂(TG)的测定

TG测定分为化学法和酶法两大类。目前尚无公认的TG测定的参考方法，二氯甲烷硅酸变色酸法是美国疾病预防与控制中心(CDC)测定TG采用的参考方法。卫生部北京老年医学研究所建立的HPLC测定总甘油和游离甘油的方法拟推荐为我国TG测定的参考方法。建议酶法[如甘油磷酸氧化酶过氧化物酶4氨基安替比林和酚法(GPOPAP法)]作为临床实验室测定血清TG的常规方法。一般临床实验室可采用一步GPOPAP法，有条件的实验室(如三级以上医院)应考虑开展游离甘油的测定或采用两步酶法。近年来已有学者探讨用酶标仪比色法测定血清CHOL、TG，将该法与生化法进行比较发现，酶标仪比色法消耗的试剂成本很低,操作方法简便,测定的结果准确,不需要昂贵的仪器支撑。

2.1.3 高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的测定

超速离心结合ALBK法为HDLC测定的参考方法。硫酸葡聚糖镁沉淀法(DS法)结合ALBK法被美国胆固醇参考方法实验室网络(CRMLN)作为指定的比较方法(DCM法)。1995年中华医学会检验分会曾在国内推荐的磷钨酸镁沉淀法(PTAMg2法)，但此法的主要缺点是标本需预先离心处理，结果易受高TG影响。建议匀相测定法作为临床实验室测定血清HDLC的常规方法。可供选择的方法主要有：清除法(Clearancemethod)，PEG修饰酶法(PEGME法)，包括反应促进剂过氧化物酶清除法(SPD法)和过氧化氢酶清除法(CAT法)，选择性抑制法(PPD法)，免疫分离法(IS法)包括PEG/抗体包裹法(IRC法)和抗体免疫分离法(AB法)。

HDL-C的代谢是一个复杂的过程,不同亚分类在脂质代谢中的作用不同, HDL3升高可增加冠心病( coronary heartdisease,CHD)的发生, HDL2升高则可降低患CHD的风险^[20];低HDL-C不一定会发生CDH,有文章指出,非高密度脂蛋白和HDL-C/ CHOL比率在预测心血管病发生方面与载脂蛋白相比较,有着相同甚至更好的效果。所以用HDL-C预测动脉粥样硬化存在一定的局限性。因此临床实验中如何准确的检测HDL-C显得异常重要。

2.1.4 低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的测定

超速离心结合ALBK法为HDLC测定的参考方法。 1995年中华医学会检验学会曾在国内推荐聚乙烯硫酸沉淀法(PVS法)作为LDLC测定的常规方法，但此法的主要缺点是标本需预先离心处理，结果易受高TG影响。建议匀相测定法作为临床实验室测定血清LDLC的常规方法。可供选择的方法主要有：表面活性剂清除法(SUR法)，过氧化氢酶清除法(CAT法)，杯芳烃法(CAL法)，可溶性反应法(SOL法)和保护性试剂法(PRO法)。

2.1.5 载脂蛋白(Apo)的测定

目前临床实验室测定血清apoAI、apoB含量的方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫浊度法[包括免疫散射比浊法(INA)和免疫透射比浊法(ITA)]。建议免疫浊度法作为临床实验室测定血清apoAI、apoB的常规方法，首选ITA法，其次为INA法。

2.2关于血脂异常分层

1、高胆固醇血症的切点目前是人为制定的，CHOL<5 .18mmol/l时为合适范围，chol≥6.22mmol/l是危险性升高，chol在5.18-6.22时为危险性边缘升高。

2、LDL-C与CHOL的分层切点相对应，LDL-C<3 .37mmol/l与chol<5.18mmol/l接近，ldl-c≥4.14 mmol/l与chol≥6.22mmol/l接近。

3、HDL-C<1 .04mmol/l为减低，hdl-c在1.04-1.5mmol/l之间为正常，hdl-c≥1.55mmol/l为理想水平。

4、TG<1 .70mmol/l为合适范围，tg≥1.70mmol/l为升高。

现在美国胆固醇教育计划NCEP-ATPÓ报告( 2001)中以CHOL<5 .12mmol/ l( <200mg/ dl)为合适水平, 5.12~6.12mmol/ l( 200~ 239mg/ dl)为边缘性增高。≥6.12mmol/ l(≥240mg/ dl)为高chol血症,制定hdl- c<1.10mmol/ l( <40mg/ dl)为冠心病危险水平, ≥116mmol/ l(≥60mg/ dl)作为负危险因素,将ldl-c划分为5个层次,对tg分为4个层次。

2.3目前血脂检测的状况

目前我生化室可检测CHOL、TG、HDLC、LDLC、ApoA1、ApoB。而许多实验室已将Lp(a)的检测用于动脉粥样硬化性心、脑血管性疾病的临床诊断。

2.3.1血清Lp( a)

血清Lp( a)浓度主要由基因调控,不受性别、年龄、体质、适度体育锻炼和降胆固醇药物的影响。目前临床实验室测定血清Lp(a)的方法多为免疫学方法，主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫浊度法包括免疫散射比浊法（INA）和免疫透射比浊法（ITA）等。国内建议免疫浊度法作为临床实验室测定血清Lp(a)的常规方法。试剂所用抗体应为多克隆抗体或混合数株识别apo(a)上不同抗原位点的单克隆抗体。首选ITA法，其次为INA法[5]。这类方法可以全自动分析大批量样本,精密度较好,但是, Lp( a)分子大小的高度不一致性、Lp( a)中蛋白的不同、Lp( a)与纤溶酶原氨基酸序列的同源性及应用校准物的不同等影响着免疫浊度测定法的结果。有文献报道,通过测定Lp(a)-胆固醇[ Lp( a)-C]来表示Lp( a)含量可避免免疫浊度测定法的缺点。植物凝集素法、超速离心法和/或琼脂糖凝胶电泳法都可用于Lp(a)-C。但是,植物凝集素法第1步需手工操作,操作繁琐,技术要求高;超速离心过程费时、成本高;电泳分离脂蛋白的精密度差。所以,通过测定Lp( a)-C来表示Lp( a)含量的方法在常规实验室检测中存在一定的普及困难。此外，设法测定血浆Lp(a)中胆固醇[Lp(a)-C]的方法，可避免或减少因为apo(a)多态性不同所造成的Lp(a)定量的不准确性。测定方法有超速离心法、麦胚血凝素法和琼脂糖凝胶电泳法，后两种方法在临床应用较多。

2.3.2Lp(a)的免疫透射比浊测定原理：

血清中Lp(a)与试剂中特异性抗体相结合，形成不溶性免疫复合物,使反应液产生浑浊，浊度高低反映血清标本中Lp(a) 含量，通过Lp(a)校准血清所作的剂量一效应曲线计算血清标本中Lp(a)含量。

3．血脂检测的临床意义

近20年以来国内外主张以显著增高冠心病危险的水平作为血脂水平异常划分标准，同时也根据危险水平进行干预及制定治疗目标。建议采用我国的“血脂异常防治建议”中的血脂水平异常的划分标准。

血脂水平异常在心血管疾病尤其是冠心病的防治中极为重要，进行血脂测定结果分析时应考虑分析前变异对测定结果的影响。1）、高胆固醇血症是动脉粥样硬化的主要危险因素之一。血清CHOL水平越高，冠心病发病越多越早。2）、人群中血清TG水平呈明显的正偏态分布。前瞻性研究分析显示高TG也是冠心病的危险因素。虽然继发性或遗传性因素可升高TG水平，但临床中大部分血清TG升高主要见于代谢综合征。3）、低HDL血症也是冠心病的重要危险因素。血清HDLC水平越低，发生动脉粥样硬化的危险性增加。4）、LDL属于致动脉粥样硬化脂蛋白，血清LDLC水平越高，动脉粥样硬化的危险性越大。5）、正常人血清apoA1水平约为1。20～1。60g/L。一般情况下，血清apoA1与HDLC呈明显正相关。但在一些病理状态下apoA1的含量不一定与HDLC成比例。我国的“血脂异常防治建议”和美国NCEPATPⅢ都要求临床常规血脂测定中应包括CHOL、TG、HDLC及LDLC这四项。

综上所述，弄清2型糖尿病患者血脂异常的表现，阐明其发生机制及严密观察2型糖尿病血脂变化情况，对糖尿病肾病及糖尿病视网膜病变的发生、发展、治疗和控制均有积极的意义。同时，正确认识糖尿病肾病和视网膜病变间的关系，有利于对糖尿病微血管并发症的筛查、诊断及防治。而血脂指标主要反映脂代谢状态，可用作冠心病风险程度的估计，但都不是冠心病诊断指标。但对于高脂蛋白血症与异常脂蛋白血症，血脂测定则为必要的诊断指标。应避免把危险因素当作诊断指标看待，才能做到血脂分析的合理应用，恰如其分的评价其应用价值。