艰难梭菌感染的实验室诊断

周晓燕

艰难梭菌（clostridium difficile）是一种专性厌氧革兰氏阳性芽孢梭菌，一般认为是环境和人类肠道中的正常菌群。长期应用抗生素、免疫抑制剂或化疗药物使耐药的艰难梭菌产毒株过度繁殖并释放毒素是导致艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）的主要因素。艰难梭菌可产生毒素A和毒素B，侵入肠黏膜后引起细胞病变，导致一系列感染相关临床表现，包括无症状携带、轻中度腹泻和危及生命的假膜性肠炎。由艰难梭菌引发的医院感染日益被人们重视。艰难梭菌肠炎多系医院内感染，几乎所有抗菌药物均可诱发本病。

一艰难梭菌的生物学特性

艰难梭菌是人类肠道中的正常菌群之一。它是一种专性厌氧菌，约（1.3～1.6）μm×（3.6～6.4）μm，为革兰阳性粗大杆菌，有鞭毛，位于菌体近端至颈端有卵圆形芽孢，无荚膜。艰难梭菌芽孢在体外环境中存活数周至数月，在100℃的温度下1ｈ死亡。常规的厌氧培养法不易生长，在头孢西丁、环丝氨酸、果糖琼脂组成的环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂（CCFA）平皿上生长良好，形成边缘不齐、粗糙的黄色菌落，在紫外线照射下呈黄绿色荧光，通过细菌的形态、菌落、生化反应、细菌毒性试验可以鉴定此菌。

二致病机制

正常成年人的肠道菌群以厌氧菌和一些兼性厌氧菌为主，如双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌等。正常情况下，肠道中的微生物之间维持一种稳态，它们相互依存、相互制约。但是在长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂或化疗药物时，一些较为敏感的细菌，如双岐杆菌等可被杀死，肠道微生态平衡受到破坏，导致比较耐药的艰难梭菌产毒株过度繁殖并释放毒素，这些毒素的半胱氨酸蛋白酶区域（CPD）与六磷酸肌醇（IP6—广泛存在于叶类蔬菜和胃肠道中的物质）结合，促进毒素裂解，裂解的碎片能穿透肠壁细胞，导致胃肠道出血性损伤，引起炎性反应和腹泻。艰难梭菌致病主要因为产生A、B两种毒素。毒素Ａ又称肠毒素导致回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分泌和出血性坏死；毒素Ｂ又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。毒素Ｂ的毒力较毒素Ａ强10倍。大多数产毒株同时产生A和B两种毒素。过去认为毒素Ａ在艰难梭菌感染的发病中起重要作用，毒素Ｂ只起辅助作用，并不能单独导致感染。然而，近年来有研究表明，毒素Ｂ对于艰难梭菌感染的发生、发展才是至关重要的，只产生毒素Ａ的艰难梭菌菌株是没有毒性的。在艰难梭菌感染患者的粪便中发现毒素Ａ阴性、毒素Ｂ阳性的菌株；而毒素Ａ阳性，毒素Ｂ阴性的菌株尚未被发现，表明毒素Ｂ可以单独导致艰难梭菌感染。但关于毒素Ａ与毒素Ｂ在艰难梭菌感染发病中的重要性还需要进一步研究阐明。毒素Ａ与毒素Ｂ分别由TcdＡ和TcdＢ基因编码，而其表达被认为是由TcdＣ基因下调或缺陷引起的，TcdＣ基因的缺陷与粪便中的毒素Ａ和毒素Ｂ数量增加有关。

三实验室检测

1艰难梭菌培养

艰难梭菌是厌氧菌，细菌培养难度大，容易获得假阴性结果，阳性率因操作人员经验的不同而异。影响因素有：①标本在空气中放置过久，操作时间过长；②所用培养基不是新鲜配置；③未用选择培养基；④培养基中未加入必要的补充物质；⑤用硫乙醇酸盐作为唯一厌氧培养基；⑥无合适的厌氧罐；⑦催化剂失活或充入气体的比例不合适，培养时间太短。如培养为细菌阳性者，也不能区别携带者或患者，因为某些艰难梭菌并不产生毒素因而不致病。环丝氨酸头胞西丁果糖琼脂(CCFA)是最早从粪便标本中分离艰难梭菌的选择性培养基。在厌氧环境中培养48h后艰难梭菌生长为黄色毛边样粗糙菌落。在CCFA中加入牛磺酸胆盐能增加艰难梭菌芽胞的分离率。某些非产毒素型艰难梭菌可定植于人体而不致病，健康成人粪便中携带率为3%，住院患者粪便携带率为16%-35%，此比例与住院时间和抗生素使用量相关。培养方法敏感性高，但少数非产毒素菌株也能在选择性培养基生长，因此培养方法的特异性还有待提高。

2酶联免疫法(EIA)检测毒素A/B

大多数临床实验室采用EIA检测TcdA和/或TcdB用于诊断艰难梭菌感染性疾病，目前已有TeehLabToxA/Bll、MeridianPremier、TeehLabToxA/BQuikChek、RemelXpeet、MeridianImmuno-acrd、BoimereiuxVIDAS等多种商品化试剂盒投入使用。EIA的优点是特异性高，能区分产毒株和不产毒株，并且检测周期短，数小时即可出结果。缺点是灵敏度不如培养方法高，并且不能得到菌株用于分子分型等进一步研究。

3 EIA检测谷氨酸脱氢酶(GDH)

谷氨酸脱氢酶(GDH)是一种存在于艰难梭菌细胞壁抗原性蛋白，它比EIA检测毒素A/B更加灵敏;但是GDH也可存在于无毒性艰难梭菌和某些其他细菌中，因此该方法特异性较低，是一种有效的筛查试验。

4细胞毒性试验(CCTA)

CCTA被认为是实验室确诊艰难梭菌感染性疾病的“金标准”。该方法将粪便滤液与Veor或HepGZ细胞一起孵育，分别加入和不加入抗毒素A/B的中和抗体。然后分别在24、48h显微镜下观察细胞病变效应(细胞凋亡而变圆)，而加入抗毒素抗体能阻止这种细胞病变。CCTA需要细胞培养及显微镜观察的相应设施和技术，并且耗时长，因此限制了它在临床常规实验室的应用。

5产毒素培养(TC)

TC是检测粪便中产毒素型艰难梭菌，试验阳性说明患者腹泻具有传染性。由于它操作繁琐并且判定结果需要一定经验的技术人员，因此不适宜临床常规检测。若用EIA直接对菌落进行毒素检测，则TC阳性结果可在1-2d内获得。TC是检测具有产毒素能力的菌株或芽胞，而CCTA是检测艰难梭菌毒素。同一粪便标本可能CCTA阴性而TC阳性，产毒素型艰难梭菌存在于2%健康人和7%-25%住院患者，这部分人群中多数无艰难梭菌感染性疾病，因此对这些患者需进行仔细的临床评估。

6 聚合酶链反应(PCR)检测毒素A/B基因

PCR检测艰难梭菌的平均灵敏度为90％，特异度为96％，实时PCR技术对艰难梭菌感染的确诊具有灵敏度、特异性高等优点。另有研究用多元化实时PCR（RT－PCR）检测艰难梭菌毒素A/B基因诊断艰难梭菌感染。与标准毒素培养比较，多元RT－PCR的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为100％、98.3％、84.6％和100％，仅3h即可获知结果，比毒素培养法快，使用方便。

7环介导等温扩增(LAMP)

LAMP技术针对靶基因设计特异性引物，通过高活性的链置换DNA聚合酶进行恒温(63-67℃)扩增反应。该方法耗时短，操作简便，可通过显色试剂肉眼判断结果，因此适用于基层医院及小型实验室快速检测。

8多种方法联合检测

由于上述方法各自存在局限性，有学者提出用2-3种方法联合检测来诊断艰难梭菌感染，从而弥补各自方法的局限性，达到比较满意的阳性预测值和阴性预测值。

综上所述，现有艰难梭菌感染检测方法各自有优势和局限性。Ba--rbut等在欧洲调查了8个国家212家医院实验室的艰难梭菌检测情况，其中87.7%的实验室常规开展艰难梭菌检测。所用检测方法中毒素A/B检测占93%，艰难梭菌培养占55%，GDH检测占5.9%。我国目前仅少数医院开展艰难梭菌检测，方法主要为毒素A/B检测。

四 展望

目前，艰难梭菌在欧美很多国家的医院感染中成为臭名昭著的“超级细菌”。寻找敏感、准确、快速的实验室诊断方法成为当前抗击艰难梭菌战役中最重要的环节之一。培养方法敏感性高，但少数非产毒素菌株也能在选择性培养基生长；免疫学方法因其简单、经济、快速可以作为艰难梭菌感染诊断的初筛试验；分子生物学方法的出现尤其是快速、灵敏的商品试剂盒的不断更新给艰难梭菌快速准确诊断带来了新的曙光。临床实验室应根据实际条件选择相应的方法对艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）做出早期诊断，为早期治疗提供依据。