乙型肝炎病毒基因变异的探究

张玉英

乙型肝炎病毒（HBV）为一嗜肝细胞DNA病毒，可引起慢性肝病及肝硬化、肝细胞癌的发生，因其感染呈世界性分布，已一个全球性公共卫生问题。HBV基因组又称HBV DNA，由3200碱基对组成，为环状部分双股DNA，分为长的负链（L）和短的正链（S）两股。L链其核苷酸（nt）长度为3.2kb有4个开放读码区（S、C、P、X区），分别编码外膜蛋白、核心蛋白、X抗原和DNA多聚酶。它们都可以发生变异，病毒变异后常引起其生物学特性发生改变，尤其是HBV编码蛋白发生变异，可以导致HBV感染发病机制的变化。

利用聚合酶链反应（PCR）及扩增产物直接测序等分子生物学技术的方法可以使人们从分子水平认识病毒及其变异。目前，已发现的HBV基因型有A- H 8种，通过对其全序列分析，发现不同基因型之间S区段异质性大，而相同基因型之间S区段的异质性小，由此发展了一系列简单、准确的分型方法，从而推动了HBV基因型的流行病学及临床相关研究。

一、前S/S基因变异

S区基因编码病毒的包膜蛋白，包括S、M和L三种蛋白，具有附着和侵入细胞，促使病毒的装配和分泌、阻断宿主的免疫应答使感染持续等功能。S基因携带与免疫应答有关的B、T淋巴细胞表位，其中a决定族是提供保护性免疫的免疫源，a决定簇变异会影响HBsAg的抗原性和免疫原性。

S区的变异分为自发性突变、人群选择和免疫逃逸。免疫逃逸的结果导致出现了疫苗逃逸突变株、诊断逃逸突变株以及抗病毒耐药突变株。在慢性HBV感染，天然发生的逃逸突变还可能发生HBV携带者的抗-HBs选择，其结果是在某些慢性携带者，同时出现HBsAg、抗-HBs，但这种抗体未能有效针对循环中存在的抗原，因此不具有保护作用。因此常见的HBsAg、抗-HBs共存多见于依次感染不同的病毒亚型，所产生的抗体未能有效抗a决定簇，因为a决定簇内氨基酸的替换可导致HBsAg构想的改变，从而改变其与抗体结合。还有研究发现，HBV基因组剪接S基因区产生的大分子蛋白变异体可导致肝细胞空泡化及肝细胞凋亡作用，与HBV感染导致肝细胞直接病变有关。由此可见，S基因的多处变异均可影响HBsAg的抗原性，导致HBsAg（－）HBV感染。

二、C基因变异

HBV的C区开放阅读框架根据第1和第2个起始密码子ATG，可分为前C区和C区。前C区位于C基因上游，含有起始密码子，编码HBeAg，其基因ntl896G-A是HBV最常见变异之一，可使前C区第28位密码子TGG转变为终止密码子TAG，导致前C蛋白翻译中HBeAg不能合成，但它并不影响病毒复制，因此，临床上表现为HBV-DNA（+）、而血清中HBeAg转换为抗-HBe，掩盖病情（如临床上常见的“大三阳”转变为 “小三阳” ），误导临床治疗。此外，前C区突变的HBV毒株可引起重症肝炎。

C基因区编码HBcAg，核心抗原多肽包含一个装配结构域和一个鱼精蛋白样结构域，装配结构域对核心颗粒的自主装配，病毒机制的分泌起主要作用；鱼精蛋白样结构域，对核心颗粒的自主装配和维持衣壳的形态起辅助作用。C区的突变点位于装配结构域，最常见的变异为密码子I97L、Y38H、L60V、P5T及Y38H/L60V双突变，可影响核心颗粒组装、病毒粒子分泌及免疫系统对HBcAg的识别，从而降低对病毒的清除，造成HBV感染的持续和慢性化。

三、X区变异：

X基因编码含154个氨基酸的X蛋白，该蛋白可反式激活HBV病毒基因，此区变异影响到病毒的转录和复制。其变异主要包括BCP变异和X基因羧基端的缺失变异，主要指HBV BCP区ntl762碱基由A-T和ntl764碱基由G-A变异，该变异出现使HBeAg水平下降，但对C区mRNA及病毒其他基因转录无影响。HBV BCP内有3个AT丰富区，可与TATA结合蛋白进行结合从而调节前C mRNA与前基因组mRNA的转录，使得HBeAg和HBcAg翻译及HBV装配障碍，因此在HBV BCP区域里发生的基因突变会接导致病毒体生物学特性和HBV发病机制发生的重要改变，是隐匿性感染的可能原因之一。此外，HBx蛋白第114?154位氨基酸的点缺失变异可抑制P53基因的抑癌作用。

四、P基因变异

P区最长，横跨整个基因组的80%，并且与其他3个ORF相重叠编码DNA多聚酶，具有逆转录酶活性，此酶既有以RNA为模板合成DNA的逆转录酶功能，又有催化合成DNA的多聚酶功能，故成为目前研究抑制病毒复制药物的靶子。P基因编码产物从功能上分为（1）末端蛋白，可与HBV负链的5'端共价结合，引导HBV负链的合成；（2）间隔区，尚未发现此区有特殊功能；（3）RNA酶H，它可裂解逆转录过程中形成的RNA-DNA杂交体中的RNA；（4）逆转录酶区，其性质为RNA和DNA依赖的DNA聚合酶，其性质为RNA和DNA依赖的DNA聚合酶，催化HBV的逆转录和DNA链的合成。

服用核苷类药物1年以上，引起HBV变异而耐药是不可避免的，目前体内外实验均证明耐药性的产生与P基因变异有关。长期使用核苷类似物抗HBV药物后，常在逆转录酶区基序上发生耐药性突变。拉米夫定能显著降低HBV DNA水平，并可使ALT正常化和肝组织学改善，对HBV复制中逆转录的抑制作用十分明显。但长期使用拉米夫定的患者体内会发生HBV耐药性，使血清中已经转阴的HBVDNA重新出现，甚至伴有病情的突变。拉米夫定作用于DNA P活性部位酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸基序（YMDD），当发生基因变异时，YMDD基序出现氨基酸转换，大多是此区的第552个密码子即蛋氨酸被缬氨酸取代即YVDD变异或被异亮氨酸取代即YIDD变异。阿德福韦酯的耐药主要出现在逆转录酶区B区和D区，常发生点突变分别为A181T/V和N236T。有研究显示，位于C、D间区的rtV214A或rtQ215S及两点的联合变异可能与阿德福韦酯耐药有关。引起ADV耐药的HN236T变异株并不影响对LAM的敏感性，但rtA181I7V、rtV214A、rtQ215S变异株可同时导致与LAM的交叉耐药。恩替卡韦耐药的先决条件是LAM耐药变异的存在。LAM耐药变异株rtI169T、rtT184A/G/I/S、rtS202G/I或HM250V等变异的出现可造成ETV的耐药。体外试验显示：在未出现LAM耐药时，rtM250V可使该药的EC50增长9倍，而rtTl84G+rtS202I并无耐药性。山于HBV病毒基因变异产生的耐药性，现有抗病毒药物都不足以清除病毒或在大部分慢性乙型肝炎患者中达不到持续的病毒抑制作用，因此应对病毒的耐药机制进行更深入的研究及探索联合药物治疗。

随着抗HBV核苷类似物的临床应用，正确认识核苷类似物耐药性，这些问题已成为临床医师关注的焦点。变异是生物适应环境生存的重要方式，在HBV感染的过程中自然发生或在治疗的诱导下产生变异，变异株影响着抗原的表达，可逃避疫苗免疫，还可引起耐药，改变发病机制和病理过程，HBV基因的变异应引起临床在诊断、治疗、预防、预后等方面的足够重视。