EGFR基因突变检测技术进展

作者: 时间:2014-03-21 点击数:

GFR基因突变检测技术进展

郭雅琪

着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展,肿瘤治疗的模式由经验性指导治疗逐渐走向基因导向的个体化治疗。近年来,表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)成为肿瘤治疗及抗肿瘤药物研究的热点。EGFR在多种肿瘤细胞中存在突变或扩增的情况,已经检测到的突变数量最多的是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在突变型NSCLC患者的治疗中得到了广泛的应用,因此,在肺癌患者中开展EGFR基因突变检测已成为临床治疗的迫切需求。

近期,我院医学实验中心科研组PCR室已面向临床开展了“ARMS法检测EGFR、Kras、Braf基因突变”的检测项目,将为我区及周边省份肿瘤患者的靶向治疗及预后评价提供良好的依据。

目前用于EGFR基因突变检测的主要方法有直接测序法、AEMS、DHPLC、HRM、PCR-SSCP、突变富集体PCR及微数字PCR等。下面将对这些检测方法进行简单介绍:

1、直接测序法

直接测序法利用的是Sanger测序法的原理,是目前公认的进行EGFR基因突变检测的金标准。其优势在于相对成本较低,非常直观,可以直接读出DNA的碱基序列,对于已知和未知的突变均可以进行检测。其缺点在于需要对测序样品扩增、纯化、序列分析,过程比较繁琐、耗时长,且对取材和技术要求比较高,对环境和操作者有危害。更重要的是直接测序法灵敏度有限,肿瘤组织的突变含量至少达到20%才能被直接测序法检出。

2、焦磷酸测序法(Pyrosequencing)

焦磷酸测序技术是新一代的DNA序列分析技术,其原理是在每一轮测序反应中,只加入一种dNTP,若该dNTP与模板配对,聚合酶就可以将其掺入到新合成的DNA链中并释放出焦磷酸基团(PPi)。经过一系列的酶级联化学发光反应,PPi转化为可见光信号,而信号的强度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。因此,无需电泳无需对DNA片段进行荧光标记,就可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其不足在于不如直接测序普及,测序长度短,易污染。

3、探针扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)

原理为:利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性,PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,针对不同的已知突变,设计适当的引物以检测出突变基因。该法在设计引物时,在引物3'端设计一错配碱基,一个与野生DNA互补,一个与突变DNA互补,使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。扩增后的PCR产物可通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)进行定量分析。目前已有两种较为成熟的商品化试剂盒问世,一种是英国DxS公司生产的DxS ARMS EGFR检测试剂盒,另一种是我国厦门艾德生物医药科技有限公司生产的Adx ARMS EGFR检测试剂盒,二者均可检测29种常见突变。前者使用的是蝎形探针,后者是双环探针。ARMS法较直接测序法的敏感性更高,其检测结果与临床疗效的一致性更好,纤维支气管镜活检等小标本和血浆或血清标本的EGFR突变检测更适合用ARMS法。但ARMS法需要特殊探针,每次仅能检测一种突变。

4、变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)

DHPLC是利用发生错配的杂合双链DNA与纯合双链DNA解链特征的差异将它们分离开来。由于杂合双链DNA错配位点处氢键被破坏而形成“鼓泡”,在部分加热变性的条件下,更易于解链形成Y形结构,与固定相的结合能力降低,所以杂合双链将先于纯合双链被洗脱出来,通过洗脱峰的不同就可判断是否有突变存在。与测序法相比,DHPILC简单、快速、敏感性高,不仅可用于已知突变的检测,还可以用于未知突变的扫描。DHPLC不足之处:只能检测有无突变,不能检测出同源突变和突变类型。结果判读容易出错,且当有多个片段需要检测时,由于有多个解链温度,需要多步检测,增加了工作量。

5、高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting analysis,HRM)

利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列熔解曲线不同,在PCR后直接运行高分辨熔解进行样品突变分析,应用其极高的温度均一性和温度分辨率,可对0.1℃差异进行分辨,使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。每一段DNA,因组成的碱基不同,形成独特的熔解曲线,如同DNA指纹图谱一样,具有很高的敏感性、特异性、稳定性和重复性。与测序法比较,灵敏度高,可用于体细胞突变的检测和测序前突变的筛选。该方法无需序列特异性探针,也不受突变碱基位点与类型的局限,操作简单,无需PCR后续操作,选择性好。但该法只能分析纯度单一的小片段DNA,且要求有足够的模板,模板含量不少于1ng时能得到稳定可靠的结果。

6、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-Single strand conformation polymorphism analysis,PCR-SSCP)

单链构象多态性是指单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间构象,当碱基发生改变时,单链DNA的会形成不同的构象。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,单链DNA迁移率除与DNA长度有关外,更主要取决于DNA单链所形成的空间构象,相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异,所形成的构象就会不同。PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳,有碱基插入、缺失或替代突变的单链就会出现不同的电泳条带。与直接测序法相比,PCR-SSCP灵敏性更高,无需特殊仪器,还可以对未知的突变进行检测,但也有其局限性:电泳时间较长,操作步骤比较繁琐,只能进行定性分析且需要平行的标准对照,受实验条件影响较大,容易出现假阴性。

7、突变体富集PCR(mutant-enriched PCR)

突变体富集PCR是一种用限制性内切酶选择性消化野生型EGFR基因的两步法PCR,在第一次PCR后选择性消化野生型的EGFR基因,从而使突变的EGFR基因得到富集,然后再进行第二次PCR,最后用电泳检测PCR产物,根据PCR产物的性质(大小或有无)来判断EGFR基因是否发生突变。与直接测序法相比,由于突变体富集PCR有两次PCR扩增,检测EGFR激活突变灵敏性更高,特异性强更强,能从103-104个野生型拷贝中检测到一个突变基因,但该方法也存在明显的不足:需要两次PCR,而且需要酶切,操作复杂、耗时长且容易污染。

8、微数字PCR(microfluidics digital PCR

微数字PCR是以集成流路(integrated fluidic circuits,IFC)芯片为基础的数字PCR技术。原理为:将样品作大倍数稀释和细分,直至每个细分试样中所含有的待测分子数不会超过1个,再将每个细分试样同时在相同条件下PCR后通过基因芯片逐个计数,是一种绝对定量的方法。该方法污染几率小,敏感性可以达到一条DNA链的水平,是目前已知敏感性最高的EGFR基因突变检测方法,尤其适合于肿瘤DNA含量较少的体液类标本的检测。相比于组织学的结果,采用该方法检测血浆标本的敏感性和特异性分别高达92%和100%。该方法的不足在于其成本较高且目前并不普及,对于临床的指导意义还有待进一步的验证。

综上所述,目前直接测序法仍为EGFR基因检测的金标准,但由于其敏感度较低,仅用于组织标本的检测,限制了临床应用。焦磷酸测序法的敏感性在5%-10%,特别适合已知序列的检测,既有与直接测序法类似的直观优势,又可以对突变进行相对定量。突变体富集PCR、HRM、ARMS及微数字PCR的灵敏度和特异性较高,可用于检测血清中微量游离的EGFR突变基因。这几种方法中,突变体富集PCR需要电泳检测;HRM虽然自动化程度提高,但只能分析纯度单一的小片段DNA,且要求模板含量不少于1ng;而ARMS和微数字PCR相对于其他几种方法,自动化程度大大提高,花费时间更短,操作更简单。随着Scorpion探针、IFC芯片等新技术的不断出现和成熟,ARMS及微数字PCR在临床基因诊断中将会呈现无可比拟的优越性。

目前EGFR突变检测样本主要为组织石蜡切片标本,但是NSCLC患者在确诊时超过70%患者已为ⅢB期、Ⅳ期,大部分失去了手术机会,肿瘤组织难以获取,而这部分患者往往是需要EGFR-TKI治疗的人群。因此,近几年来越来越多的研究用于细胞学及血液样本中EGFR基因的检测,而这些标本往往由于DNA含量的限制,要求检测方法具有很高的灵敏度。所以开发出更多灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法将会在临床EGFR突变检测中有很大的应用前景。

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