微阵列比较基因组杂交技术在产前诊断中的应用

作者: 时间:2014-03-21 点击数:

微阵列比较基因组杂交技术在产前诊断中的应用

于辛酉

前诊断是预防遗传病患儿出生的主要途径。目前中期染色体核型分析是产前细胞遗传学检测的金标准,它可以检测5~10兆碱基的染色体组非整倍性异常,包括缺失、重复以及其他染色体重排。最近10年随着新的细胞遗传学和分子遗传学技术的出现,产前诊断技术飞速发展,临床医生对发育中的胎儿有了更全面的了解。近年来,微阵列一比较基因组杂交(microarray comparative genomic hybridization, aCGH)技术用于临床细胞遗传学领域及染色体病的研究,可对染色体亚微结构异常进行诊断定位。本文对目前基因芯片在产前诊断中的应用进展作一综述。

1.aCGH的原理

array-CGH技术的基本原理与CGH相似,差别之处是使用微阵列代替中期染色体作为杂交靶。微阵列上分布有全基因组DNA片段或cDNAs片段。array-CGH的基本原理如下图所示:

图1:Array-CGH原理示意图

array-CGH的原理是直接比较两个经过不同标记基因组之间DNA拷贝数的差异。即两个基因组(病人待测DNA和对照DNA)分别经不同的荧光染料(如生物素)进行标记,再与足量的人cot-1DNA结合封闭IRS,然后共同杂交到微阵列上(通常是特制的玻片),这些玻片上已经事先固定有标准的全基因组DNA片段。这些杂交靶上DNA的片段大小范围从寡核苷酸(25-85bp)到细菌人工染色体(BACs: 80-200 kb)不等。杂交后经配套的扫描仪扫描和摄像,并用专门的分析软件处理数据。需要确定实际的靶区域、靶信号强度和局部背景强度。从靶信号强度中扣除局部背景强度得到靶信号比率。将正常标本在微阵列中全部靶点的平均信号比率调整为1 ,这代表无DNA拷贝数的变化。利用全部靶点的平均信号比率( M)和标准差( s)确定拷贝数变化的界限。扩增和缺失分别定义为>( M + 2 S)和< ( m - 2s),高水平扩增定义为> (2M+ 2s)。分析时去除在正常样本中信号不足的点(荧光信号高出背景< 20 %)和有过多信号残骸的点,以提高检测技术的信噪比。dna拷贝数图像可以用移动平均值(moving average) (5个相邻的靶点)显示。移动平均值用于减少靶信号交叉引起的误差和降低背景。

2.aCGH技术在产前诊断中的应用

目前aCGH技术已广泛应用于遗传性疾病的临床诊断,由于该技术可在基因组水平上检出<100 kb的染色体微缺失或微重复性不平衡重组,因此,最近该技术已应用于产前诊断领域,其优势包括:能够得到全基因组规模的数据、不需要进行羊水或绒毛细胞培养、自动化操作、快速得到结果,且可用于死亡胎儿或流产组织染色体异常的病因诊断。目前该技术已在欧美、日本、韩国、中国香港等国家和地区的产前诊断及新生儿诊断中得到应用。

以哥伦比亚大学医学中心为主的研究人员历时四年进行了一项临床试验,评估了基因芯片在产前诊断中的应用前景,并与染色体核型分析进行了比较。研究结果表明:98.8%的样本可用于芯片检测,87.9%的样本无需组织培养即可直接检测。基因芯片技术可以识别出传统核型分析所能检测的所有非整倍体和不平衡重排,但对识别平衡易位和胎儿三倍体却无能为力。研究人员同时指出,有时核型分析并未检测到,但超声检查发现胎儿生长或结构异常的这类病例中,有6%都可以通过芯片检测发现染色体的缺失或重复。对于高龄产妇或产前筛查呈阳性的病例来说,在核型分析为正常时,有1.7%却可以经由芯片检测到异常,从而提供更多的细胞遗传学信息。

Rickman等利用盲法研究30份从羊膜腔穿刺术(AC)和绒毛膜穿刺术(CVS)提取的胎儿DNA样本,在包含有600个大片段插入克隆的靶向诊断微阵列检测中,与传统核型分析结果一致性的样本有29/30,但是使用分辨率为1Mb的全基因组微阵列,结果一致性只有22/30,其他的微缺失都不能被传统核型分析方法识别,这说明可以根据诊断目的设计不同分辨率的微阵列。Ignatia等使用array-CGH对超过100份样本进行产前诊断,胎儿DNA直接从样本中提取或者从培养的细胞中提取,只用7天就出报告,比起以前的核型分析需要平均14天要短得多,并且所有的检测结果都能被G显带技术和FISH技术验证。Triloch等对57例孕妇进行array-CGH和常规G显带核型分析,两者的符合度为98%。Array-CGH也用于研究自然流产或死胎,这些流产或者死胎组织培养不成功,因此没有普通核型分析的结果,但是使用array-CGH都能作出诊断。array-CGH可以对经过固定或体外培养不成功的组织细胞进行分析,因此可以发现更加复杂的染色体畸变,例如双三体性,这些异常的样本体外根本无法培养成功。

流产胎儿中有约5%结构正常的死胎存在异常核型。而35%~40%的死胎存在结构异常这些病例常需要被评估,因为它们的核型分析常不理想。而组织培养的成功率也只50%。Raca等报道成功利用微阵列技术检测15例表现型异常的死胎而这些病例不能采用标准的核型分析结果显示13%的病例提示异常。

3.a-CGH技术的优缺点

Array-CGH技术的出现代表了分子遗传学的新进展,该技术保留了传统的CGH技术的所有优点,并且拥有分辨率高、自动化、程序化的独特优势,在一次实验中就能够可靠地检测出全染色体组所有的不平衡异常、全基因组所有DNA拷贝数的异常,例如所有非整倍体、缺失、重复、标记染色体、环状染色体以及嵌合体等,而不用事先知道染色体异常的发生位置。检测材料只需少量的DNA,在将来有望实现真正的无创性产前诊断,从而达到将来的细胞遗传学实验室可能不需要显微镜的全新境界。另一方面,array-CGH技术也大大加速了新基因的发现,对于基因组的拷贝数变异,人们比以往有了更好地了解,它在诊断和遗传咨询中的意义都很重大。

然而,任何一项新技术都有其自身局限性,array-CGH也不例外,首先,从芯片本身来讲,造价比较昂贵,不是一般实验室所能承担得起的,这就大大限制了它的应用和推广,尤其是在中国这个发展中国家。其次,目前的array-CGH不能发现没有伴发DNA拷贝数变化的平衡染色体畸变,例如罗伯逊易位,平衡的相互易位,平衡的插入和倒位等。另外,由于非致病性的DNA拷贝数比变异(CNV)至少累及人类基因组的12%,因此array-CGH结果的解释也面临一些挑战,染色体不平衡变异并不意味着就具有致病性。为了能够用于治疗病人和为遗传咨询提供服务,检出染色体不平衡的致病性CNV需要经过验证,就是需要对病人父母和其他家庭成员进行检测。总之,array-CGH技术使传统染色体分析与分子诊断相结合,但是这两者结合的意义也将面临需要重新考虑的挑战。

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